Únicamente la esterilización produce una mayor inactivación, mientras que los otros tratamientos no garantizan una pérdida de la actividad de betalactámicos y tetraciclinas.
La presencia de residuos de sustancias antimicrobianas en la leche puede ser la causa de problemas para la salud pública y la industria láctea.
El objetivo ha sido analizar el efecto de diferentes tratamientos térmicos (40 ºC-10 minutos, 60 ºC-30 minutos, 83 ºC-10 minutos, 120 ºC-20 minutos y 140 ºC-10 segundos) en muestras de leche fortificadas con 8 betalactámicos y 4 tetraciclinas. El método utilizado ha sido un bioensayo que utiliza diferentes microorganismos, medios de cultivo y condiciones especificas cada grupo de antimicrobianos.
Los resultados muestran que el calentamiento a 40 ºC-10 m no ocasiona inactivación térmica en la mayoría de los antibióticos. El tratamiento a 83 ºC-10 m produce una pérdida de actividad superior al 20% en cefalexina, cefuroxime y clortetraciclina.
La pasteurización (60 ºC-30 m) produce una leve inactivación sobre los betalactámicos (6- 20%) y tetraciclinas (18-31%), mientras que la esterilización (120 ºC-20 m) origina inactivaciones elevadas (65-92%). Por último el tratamiento térmico de 140 ºC-10 s (UHT) produjo pérdidas entre 7- 21% para los betalactámicos y 27-39% para las tetraciclinas.
Se puede resumir que únicamente la esterilización produce una mayor inactivación, mientras que los otros tratamientos térmicos no garantizan una pérdida de actividad antimicrobiana de betalactámicos y tetraciclinas en la leche.
Introducción
La presencia de residuos de sustancias antimicrobianas en la leche puede ser la causa de problemas tecnológicos en la fabricación de queso, yogur y otros productos lácteos (Mourot y Loussouron, 1981; Brady y Katz, 1988). Además los residuos de medicamentos en la leche puede causar serias consecuencias en la salud pública, provocando resistencias y alergias a los consumidores (Schwartz y Sher, 1984; 2001; Demoly y Romano, 2005).
Actualmente el control de calidad de la leche es imprescindible para establecer el precio que recibe el productor, así como asegurar la calidad del producto.
En los laboratorios de control es una práctica habitual realizar algunos tratamientos con calor de la muestra para su homogeneización o para la inactivación de los antimicrobianos naturales en el caso del análisis de inhibidores. Hasta el momento no existen estudios en la bibliografía que estudien como afecten estos tratamientos la presencia de los residuos de antibióticos en la leche.
Por otra parte la leche llega al consumidor después de haber sido sometida a distintos tratamientos térmicos en la industria como la pasterización, la esterilización, etc. Los estudios referentes a la influencia de estos tratamientos de la industria láctea sobre los residuos de antimicrobianos son muy escasos y se centran sobre un número muy limitado de antibióticos.
Además en el caso de los betalactámicos casi todos los trabajos se han centrado en la penicilina G (Moats, 1999), encontrándose pocos estudios sobre otras penicilinas y cefalosporinas (Jacquet y Auxepaules 1978). En gran parte de estos estudios se indica que se requieren unos tratamientos térmicos muy prolongados para la inactivación completa de los residuos de la penicilina.
En el caso de las tetraciclinas diferentes autores (Moats, 1999) han señalado una mayor inestabilidad térmica, con tiempos de inactivación menores que la penicilina, para la oxitetraciclina, tetraciclina y clortetraciclina con tratamientos térmicos superiores a 70 ºC. Por el contrario Jacquet y Auxepaules (1978) evaluaron la estabilidad térmica tras una pasteurización baja a 63 ºC durante 30 minutos de la clortetraciclina y la tetraciclina en leche con porcentajes de inactivación bajos de 2,6% y 6,1%, respectivamente.
Debido a la comentada falta de información y a la importancia que tienen la presencia de residuos de antibióticos en la leche para la industria y el consumidor, el objetivo de este trabajo ha sido analizar el efecto de diferentes tratamientos térmicos (40 ºC-10 minutos, 60 ºC-30 minutos, 83 ºC-10 minutos, 120 ºC-20 minutos y 140 ºC-10 segundos) sobre muestras de leche fortificadas con 8 betalactámicos (penicilina, amoxicilina, ampicilina, cloxacilina, cefalexina, cefalonium, cefoperazone, cefquinoma, cefuroxime) y 4 tetraciclinas (clortetraciclina, doxiciclina, oxitetraciclina y tetraciclina).
Material y Métodos
El método utilizado ha sido un bioensayo (Nouws et al., 1999) capaz de detector diferentes grupos de antibióticos. El bioensayo emplea diferentes microorganismos, reactivos, medios de cultivo y condiciones metodológicas (pH, tiempo y temperatura de incubación) para cada grupo.
En el caso de beta-lactámicos y tetraciclinas se han empleado las características de las placas han sido: Placa Beta-lactámicos: 23.5 g/L PCA de Difco liofilizado a pH a 8.0 ± 0.1. Inoculación con B. Stearothermophilus var. calidolactis C953, (Merck, Ref.1.11499) con una concentración final de 107 esporas/mL.
Las pacas se incuban a 55 + 1 ºC durante 6 horas. Placa Tetraciclinas: 25 g/L de Standard II Narh-agar liofilizado a pH a 6.0 ± 0.1 con 0.5% de una disolución 100 mg/kg de cloranfenicol. Inoculación con Bacillus cereus var. mycoides ATCC 11778 para obtener una concentración de 105 esporas/mL. La incubación se realiza a 37 + 1 ºC durante 16-18 horas.
Las muestras de leche comercial UHT se fortificaron con tres concentraciones (C1, C2=2C1 y C3=4C1) de antibióticos cuya procedencia y concentraciones se presentan en la Tabla 1.
Los tratamientos de 40 ºC-10 min., 60 ºC-30 min. y 83 ºC-10 min. se realizaron, en tubos eppendorf protegidos de la luz, en baño termostático de agua. El calentamiento de 120 ºC-20 min se efectuó en un autoclave (Selecta Presoclave 75, PL) empleando tubos de vidrio con tapón «sero-tab». En el tratamiento de 140 ºC-10 seg se utilizó un baño con aceite de silicona y tubos de acero inoxidable con un diámetro externo de 1.6 mm y 0.5 mm de espesor (Pagliani et al., 1990).
Para los análisis se emplearon placas para bioensayo NINC cuadradas (243 x 243 x 17 mm) en las que se realizaron 36 perforaciones para las muestras, tanto tratadas térmicamente como sin tratamiento, con las diferentes concentraciones de antibiótico. Se emplearon 3 placas por tratamiento (15 placas por antibiótico) Las medidas de los diámetros de las zonas de inhibición (incluido el pocillo de 14 mm) se efectuaron por duplicado con un calibre digital de ± 0,01 mm de precisión.
Para el análisis estadístico de los resultados se aplicó la opción stepwise del modelo de Regresión Lineal Múltiple (SAS, 1998), mediante el modelo:
Yij = b0 + b1 log Ci + BTj ETj + eij
Donde: Yjj: diámetro de la zona de
inhibición (mm), log Ci: logaritmo decimal
de la concentración de antibiótico (mg/kg), ß0: Ordenada al origen, ß1: Pendiente de la recta, ßTj: Coeficientes de corrección de la ordenada al origen de la recta testigo debido al efecto del tratamiento «i», ETj: efecto del tratamiento térmico en términos de variables dummy: Sin tratamiento (Z1 = 0, Z2 = 0, Z3 = 0, Z4 =0, Z5 = 0), Tratamiento 40 ºC-10 minutos (Z1 = 1, Z2 = 0, Z3 = 0, Z4 = 0, Z5 = 0), Tratamiento 83 ºC-30 minutos: (Z1 = 0, Z2= 1, Z3 = 0, Z4 = 0, Z5 = 0), Tratamiento 60 ºC-10 minutos (Z1 = 0, Z2= 0, Z3 = 1,Z4 = 0, Z5 = 0), Tratamiento 120 ºC-20 minutos (Z1 = 0, Z2 = 0, Z3 = 0, Z4 = 1,Z5 = 0), Tratamiento 140 ºC-10 segundos (Z1 = 0, Z2 = 0, Z3 = 0, Z4 = 0, Z5 = 1),
Tabla 1. Concentraciones de antibióticos empleadas para estudiar el efecto de los tratamientos térmicos sobre la actividad de beta-lactámicos y tetraciclinas.
El cálculo de la pérdida de actividad antimicrobiana se efectuó mediante elporcentaje de inactivación térmica (%IT)mediante la siguiente expresión:eij: error residual del modelo
(% IT) = [1 «“ 10 (-ßTj/ß0)] x 100
Para aquellos antibióticos que nopresentaron zonas de inhibición cuandose sometieron al tratamiento térmicode 120 º-20 segundos, se estimó elporcentaje mínimo inhibitorio como el porcentaje relativo entre la concentración máxima ensayada y la mínima concentración estimada por el modelo de regresiónque no produce zona de inhibición (14mm), mediante la fórmula:
% IT = [(Cmáx «“ C 14mm))/Cmáx] x 100
Donde: Cmáx: concentración máxima ensayada para cada antibiótico y C 14mm:concentración mínima estimada por el modelo de regresión lineal que no produce zona de inhibición (14 mm)