CALIDAD HIGIÉNICA DE LA LECHE
PRUEBA DE LA REDUCTASIMETRIA EN LECHE
Fundamento
La mayoría de los gérmenes de la leche elaboran reductasas que modifican el potencial de óxido-reducción de la misma. Para demostrar ese fenómeno basta añadir a la leche una sustancia que se decolore al pasar de la forma oxidada a la forma reducida. La rapidez con que cambia de color está en función de la población bacteriana y, por ello, puede ser un índice del grado de contaminación de la leche. El colorante más empleado es el azul de metileno, pero también se pueden utilizar la resazurina y el cloruro de 2, 3, 5, trifenil-tetrazolium, ya que son colorantes fácilmente absorbibles por las células vivas.
En general se admite que la decoloración es más rápida cuanto mayor es el número de microorganismos en la leche. Sin embargo, las bacterias presentan distinta habilidad para reducir el azul de metileno, así el Streptococcus liquefaciens, los gérmenes del grupo coliaerógenos y los de la putrefacción (Bacillus subtilis) se muestran muy activos. Las células somáticas presentes en la leche también influye mucho en la velocidad de decoloración, sobretodo los leucocitos.
Material
Tubos de ensayo con tapones estériles.
Baño maría ó estufa a 37 °C.
Pipetas graduadas
Reactivos
Solución de azul de metileno. Preparar una solución madre diluyendo unos gramos de azul de metileno en alcohol de 96 ° hasta conseguir la saturación.
Para preparar la solución de trabajo tomar 2.5 mL de la solución madre y adicionar 97.5 mL de agua destilada estéril.
Procedimiento
Agitar la leche y agregar 10 mL de leche a un tubo de ensayo.
Añadirle 0.5 mL azul de metileno, evitar el contacto con la leche.
Tapar los tubos e introducirlos en baño maría a 37 °C.
Realizar dos ensayos simultáneos para cada muestra.
Leer los resultados al cabo de 10 minutos y a la hora.
Reductasimetria 1.jpg
Observaciones e Interpretación
La presencia de microorganismos en la leche y por su acción reductora, se produce una modificación del color del azul de metileno, pasando de color azul intenso a azul claro, pudiendo desaparece totalmente de acurdo a la carga microbiana presente. Una leche con un contenido bajo en microorganismos, no modifica el tinte azul del colorante o tarda mucho tiempo en modificarlo. Ser considera que en la leche natural fresca el tiempo de decoloración del colorante en la prueba de la reductasimetría debe ser superior a las dos horas, mientras que en la certificada debe ser superior a las cinco horas, dada la mayor calidad higiénica de los productos obtenidos en las granjas diplomadas.
Reductasimetria 2.jpg
PRUEBA DEL ALCOHOL
Fundamento
Cuando se añade a la leche una cierta cantidad de alcohol etílico se produce una deshidratación, parcial o total, de ciertos coloides hidrófilos, que puede desembocar en su desnaturalización, y con ello a la pérdida de su equilibrio y floculación. Este resultado sólo se alcanza con un cierto grado alcohólico de la mezcla final, por debajo del cual las leches térmicamente estables no floculan, mientras que la leche anormal, esto es la térmicamente inestable, flocula. Todo sucede como si existiera un paralelismo entre la resistencia al calentamiento y la estabilidad en presencia del alcohol. Es posible, por consiguiente, traducir en grado alcohólico la resistencia necesaria a un procedimiento dado de calentamiento. Por lo que todas las leches estables en presencia de esta cantidad de alcohol resistirán el calentamiento correspondiente.
Basándose en este principio se ha ideado un método simple de control o de selección, que consiste en mezclar de golpe volúmenes iguales de leche cruda y de una solución acuosa de alcohol etílico de concentración conocida. La elección de esta última varía según la modalidad de calentamiento (pasterización, esterilización, etc.) a que ha de someterse la leche. La mezcla se agita en frío y se observa, preferentemente después de haberla extendido sobre una superficie de color oscuro o negra. Si no se produce floculación alguna, la leche resistirá perfectamente el calentamiento correspondiente al grado de la solución alcohólica. Si se observa floculación, la leche no se mantendrá estable durante el calentamiento. La concentración de la solución alcohólica, generalmente fijada a 68% cuando se ensayan leches para la pasterización, y debe elevarse hasta 72 ° o más (a veces hasta 74 °) cuando se trata de seleccionar leches para la esterilización. La mayor frecuencia de reacciones positivas con leche normal, excluye el empleo de etanol más concentrado para realizar esta prueba.
Material
Pipetas de 2 mL y de 5 mL.
Tubos de ensayo de 10 mL.
Reactivos
Alcohol de 68 ° (se prepara llevando 72 mL de alcohol etílico neutralizado de 95 ° hasta 100 mL con agua destilada).
Alcohol de 72 ° (se prepara llevando 76 mL de alcohol etílico neutralizado de 95 ° hasta 100 mL con agua destilada).
Procedimiento
Poner en dos tubos de ensayo 2 mL de leche y añadir 4 mL de alcohol a 68 ° y de alcohol 72 °, respectivamente.
Una vez cerrado invertir varias veces el tubo de ensayo para permitir una buena homogenización de la muestra.
Observaciones e Interpretación
Las leches ácidas inestables en presencia de calor, se coagulan en la prueba del alcohol. Las leches con un equilibrio salino incorrecto o al menos la mayoría de éstas, se coagulan en las mismas condiciones. Conviene sin embargo, subrayar que el paralelismo entre la estabilidad térmica y la inestabilidad en presencia del alcohol sólo se da en el caso de leches cuyo equilibrio salino queda destruido por un exceso de cationes (particularmente leches demasiado ricas en calcio). En cambio, las leches cuya inestabilidad térmica depende de un exceso de aniones se mantienen estables en la prueba del alcohol, pero estas leches son sumamente raras y en la práctica puede utilizarse esta prueba para eliminar aquellas con un equilibrio salino incorrecto. Las leches que contienen un exceso de albúmina por causas fisiológicas (como por ejemplo los calostros) ó patógenas (en el caso de las mastitis), se coagulan siempre cuando se les añade alcohol, incluso cuando su equilibrio ácido-base es normal y cuando no han sufrido fermentación láctea.
Aunque no existe siempre una correspondencia absoluta entre la inestabilidad térmica y la inestabilidad al alcohol (ya que se trata de procesos diferentes), esta prueba permite descubrir una gran mayoría de las leches que no podrían soportar el calentamiento en general ni la esterilización en particular, ya que incluso algunas muestras de leche fresca, normales en todos los aspectos dan a veces un resultado positivo.