El recuento de Bacterias Coliformes, es el mejor indicador del grado de higiene bajo la cual se practico el
ordeño. Dentro del llamado «grupo coliforme» se incluyen todos los bacilos Gram negativo s, aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, capaces de fermentar la lactosa con producción de gas y ácido en 48
horas, en medios de cultivo sólidos o líquidos. Los géneros que integran este grupo son Escherichia,
Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella (Flia. Enterobacteriaceae), siendo las especies más importantes
Escherichia coli y Enterobacteraerogenes
El primero en particular es huésped normal del tracto intestinal del hombre y los animales de sangre caliente,
por lo cual se encuentra en grandes cantidades en las heces y el estiércol. El segundo (E. aerogenes) también
se presenta en las heces, pero mas frecuentemente se origina del suelo y materia vegetal en descomposición.
La presencia en el agua de estos microorganismos se considera inaceptable, asociándose con
contaminación fecal y por ende con la posible presencia de otros microorganismos patógenos de origen
intestinal, como por ejemplo las especies del género Salmonella productoras de la fiebre tifoidea y disenterías
bacilares.
La leche cruda se contamina corrientemente con bacterias coliformes, derivadas directa o indirectamente del
tracto intestinal de las vacas, animales que afortunadamente no sufren las infecciones entéricas propias del
hombre. Esta contaminación puede provenir del estiércol, polvo, suelo, alimentos del ganado, agua, insectos
(especialmente moscas) o del contacto con residuos lácteos que quedan en los utensilios de ordeño y tanques
de transporte o almacenamiento, mal lavados y saneados; donde esas bacterias suelen desarrollarse con
gran facilidad. Por estas razones, es sumamente difícil producir leche cruda libre de coliformes, dándole a su
presencia una significación diferente que en el agua, y aunque es indeseable, se tolera. No obstante, altas
cuentas bacterianas de coliformes son indicativas de condiciones insanas de producción, transporte o
almacenamiento y producen defectos en la leche (sabores desagradables), razones suficientes para evitar su
desarrollo, mediante buenas prácticas de producción.
En la leche pasteurizada, a diferencia de la leche cruda, la presencia de bacterias coliformes es inaceptable ya
que a la s temperaturas de pasteurización se destruyen. Por lo tanto, una prueba de coliformes positiva en
productos lácteos pasteurizados denota mala pasteurización y aunque este hecho generalmente se descubre
por la prueba de fosfatasa, la colimetria a veces resulta mas sensible. Además, un resultado coliforme positivo
puede indicar recontaminación post- pasteurización, bien sea por los equipos sucios o defectuosos (escapes
de leche cruda, escapes de vapor condensado, etc.) por los trabajadores (manos, ropa, etc.) o por envases
mal desinfectados. Ahora bien, como no hay forma de establecer si los coniformes se originaron en la vaca o
de un ser humano, cuyas heces si pueden ser portadoras de otros microorganismos patógenos, la leche
pasteurizada coliforme»“positiva debe rechazarse.
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Dr. Roberto RODRIGUEZ
Bioq. Milena ECHEVARRIA
«Microbiología de la Leche»
Ing. Mauricio CELIS – Lic. Daniel JUAREZ
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La determinación de bacterias coliformes en la leche y otros productos lácteos pasteurizados, es sumamente
importante tanto en los laboratorios de control de calidad de las industrias del ramo como la de las agencias
gubernamentales de sanidad. Ello puede efectuarse por diferentes métodos, siendo los más comunes las
llamadas pruebas de fermentación, las cuales han sido clasificadas en presuntivas, confirmativas y completas.
Estas determinaciones pueden continuarse con pruebas de diferenciación de especies de coliformes, siendo
muy recomendables las pruebas bioquímicas del IMViC y McKeenzie.
3.8.1 PRUEBAS PRESUNTIVAS
Las pruebas de fermentación presuntivas, para establecer la presencia de coliformes en la leche y derivados,
pueden efectuarse siguiendo dos procedimientos:
a) Utilizando un medio liquido selectivo en tubos de fermentación (tipo Durham) como el caldo lactosado-bilisverde
brillante (CLBVB) o el caldo lactosado-peptona-r icinoleato- formiato. Estos medios se recomiendan
cuando se desea analizar volúmenes relativamente grandes de leche (5 a 100 mL). En el CLBVB, el colorante
(verde brillante) y la bilis actúan como inhibidores del crecimiento de las bacteria Gram positivas, pero
permiten el desarrollo de las Gram negativas; la lactosa sirve como sustrato a las bacterias coliformes que la
fermentan en 48 horas a 32 o 35 ºC, formando ácido y gas el cual es recolectado en los tubos de
fermentación, demostrando el crecimiento de las bacterias coliformes. Cuando se emplean 5 tubos del medio
liquido para cada una de 3 diluciones diferentes de leche (10, 1 y 0,1 mL) es posible obtener valiosa
información, que con la ayuda de tablas especiales permite hacer un calculo aproximado del numero de
bacterias posiblemente presentes en la muestra, resultado que se expresa en términos del «Número Mas
Probable» de coliformes por unidad de volumen (Ej.: NMP/100 mL).
En forma similar puede emplearse el caldo lactosado peptona-ricinoleato- formiato, en el cual el ricinoleato
sódico actúa como inhibidor de las bacterias Gram positivas, pero no de las Gram negativas, en tal forma que
los coliformes crecen formando gas a partir de la lactosa, reacción que es acelerada por el formiato de sodio.
b) Utilizando un medio selectivo sólido en placas como el agar- lactosa- desoxicolato- formiato o agar bilisrojo
neutro-cristal violeta. Los medios sólidos se emplean generalmente para el control sanitario de leches
pasteurizadas, con el objeto de establecer si cumplen las normas sanitarias (máximo conteo de bacterias/mL).
Tienen la ventaja de que permiten obtener resultados cuantitativos en una sola placa. Sin embargo, no se
emplean cuando se necesita utilizar volúmenes grandes de muestra. Los coliformes crecen fácilmente en el
agar lactosa-desoxicolato- formiato, ayudados por la presencia de lactosa que fermentan produciendo ácido
que hace cambiar el pH y virar el indicador (rojo neutro) de amarillo a rojo; el desoxicolato inhibe el crecimiento
de los germenes Gram positivos. El periodo de incubación de las placas con este medio, no deber ser mayor a
las 24 horas, preferiblemente 20 horas, ya que otros microorganismos pueden crecer ocasionando confusión.
Por ello solo se cuentan aquellas colonias rojas de diámetro mayor a los 0,5 mm, rodeadas de un alo de
desoxicolato de sodio precipitado.
Además, las placas se deben preparar con una capa fina superficial de medio, superpuesta, para obtener las
colonias de coliformes ligeramente por debajo de la superficie y evitar sean confundidas con colonias
superficiales. De manera similar se usa el agar bilis-rojo neutro-cristal violeta, donde la bilis y el colorante
inhiben el desarrollo de los microorganismos Gram positivos, mientras que el rojo neutro actúa como indicador.
Las bacterias coliformes crecen en este medio en 24 horas, formando colonias de color rojo púrpura (por
debajo de la capa superpuesta) de 1- 2 mm de diámetro, rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.
3.8.2 PRUEBAS CONFIRMATIVAS
Cuando se requiere confirmar la evidencia obtenida en una prueba presuntiva sobre la posible presencia de
bacterias coliformes, se acostumbra continuar el análisis con una prueba confirmativa. Esta puede efectuarse
por dos procedimientos:
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a) Utilizando un medio selectivo sólido para «repicar» o «transplantar» los microorganismos (presuntamente
coliformes) cuando la prueba pr esuntiva previa se ha hecho en medio liquido. Con tal fin se utiliza
comúnmente el agar de Levine, en el cual las bacterias coliformes se «confirman» por las características de sus
colonias. En este medio, las colonias de Escherichia coli se presentan planas o ligeramente cóncavas, de color
oscuro con el centro negro, brillo metálico verdoso (a la luz refleja) con tendencias a unirse y con un tamaño
de 2-3 mm. En cambio, las colonias de Enterobacter aerogenes se observan mas levantadas, marcadamente
convexa s, de color menos oscuro que la especie anterior, con el centro marrón, sin el brillo metálico que
caracteriza a las de Escherichia, y con un tamaño mayor, generalmente de 4-6 mm. El medio en si es de color
púrpura. Para este fin también puede emplearse el agar Endo. Ambos medios se incuban a 32 o 35 ºC por 18
– 24 horas, seleccionándose las colonias típicas para la prueba completa, cuando esta se requiere.
b) Empleando un medio selectivo liquido para «repicar» los microorganismos cultivados en la prueba
presuntiva precedente en medio sólido. Con este fin se emplean comúnmente el mismo caldo lactosado-bilisverde
brillante al 2% (CLBVB). El desarrollo de gas en este medio, confirma la presencia de coliformes, si
ocurre en 48 horas a 32 o 35 ºC.
3.8.3 PRUEBAS COMPLETAS
Cuando se quiere comprobar definitivamente la presencia de los coniformes confirmados mediante las
pruebas anteriores, el análisis puede continuarse con las llamadas pruebas completas. Estas prueban son
necesarias cuando aún existe cierta duda sobre la identidad de las colonias aisladas, especialmente en placas
con profusión de colonias; o cuando además de lactosa, existe en el cultivo otra sustancia que pudiera
fermentar, como ocur re cuando se siembra helados en tubos de caldo lactosado. Los procedimientos que se
emplean pueden ser dos:
a) Si la prueba confirmativa se ha logrado en medio sólido y en este ultimo se han aislado bien colonias
típicas de coliformes, esto es, colonias plana s o cóncavas, rodeadas de un área con brillo metálico, se
seleccionan y se «repican» en tubos de fermentación con caldo lactosado (CLBVB) que se incuban a 32 o
35 ºC durante 48 horas y en tubos de agar nutritivo inclinado que se incuban a 32 o 35 ºC durante 24 horas. La
prueba completa se considera positiva si se observa formación de gas en los tubos de fermentación y si al
microscopio del frotis de ambos cultivos, demuestra el desarrollo de bacteria en forma de bastoncitos,
Gram negativas, no esporuladas.
b) Si la prueba confirmativa previa se ha hecho «repicando « de medio sólido a liquido y se ha obtenido
formación de gas (generalmente en 18-24 horas) la prueba completa se obtiene «repicando» de nuevo en
medio sólido (agar Levine) que se incuba a 32 o 35 ºC por 18- 24 horas. Seguidamente se hacen «repiques» de
colonias típicas seleccionadas como se ha indicado en (a), es decir, haciendo cultivos sucesivos en tubos de
fermentación con caldo lactosado, en tubos de agar nutritivo inclinado y examen microscópico de los cultivos
teñidos al Gram.
3.8.4 PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES
Una vez confirmada la presencia de bacterias co liformes, mediante pruebas de fermentación presuntivas,
confirmativas y completas, utilizando medios selectivos líquidos y sólidos ; y aisladas las bacterias en cultivos
puros, el análisis puede continuars e con pruebas de diferenciación para establecer la identidad de la especie
bacteriana. Entre esas pruebas, son recomendables las del IMViC y de McK enzie, cuyo estudio constituye el
objetivo principal de esta práctica. Debe recordarse además que la identificación de las especies de
coniformes puede también efectuarse por las características de desarrollo en medios selectivos ya sea en
placas o en tubos de cultivo, siendo los más comunes los medios de Levine, Endo, McConkey (en placas) y el
medio de Costa y Vernin (en tubos).
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