Métodos basados en PCR
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa ( PCR) se basa en la detección de fragmentos específicos de genes por medio de la amplificación enzimática in vitro del DNA objetivo seguido de la detección de la molécula amplificada de DNA por electroforesis, ELISA o alguna otra técnica analítica.
Una nueva tecnología particularmente interesantes para la rápida cuantificación de DNA es la tecnología de laboratorio en un chip en la cual las separaciones electroforéticas de las moléculas de DNA y su detección se realizan con nanolitros de muestra y reactivos usando tecnología microfluída en combinación de detección fluorescente. Las ventajas de los métodos PCR/DNA son su alta sensibilidad y especificidad.
En el pasado, el PCR se limitó a la dificultad de obtener primers de DNA específico y a la producción de productos PCR no específicos. Otro problema fueron los falsos positivos porque la prueba fue incapaz de diferenciar el DNA de los organismos muertos de los vivos y de organismos viables. Recientemente el interés en PCR se ha renovado por la automatización y mejoras en los sistemas PCR que se han enfocado en los defectos antes mencionados. Con las grandes ventajas de especificidad, sensibilidad y mejoras que han corregido varias de las deficiencias ,el PCR actualmente se percibe como una opción extremadamente atractiva para la detección rápida de patógenos.
Hace 25 años, las técnicas estándar para aislar bajos niveles de Listeria en alimentos tardaba un mes. Actualmente el tiempo estructurado se redujo a dos o tres días y los nuevos sistemas basados en PCR pueden identificar Lisateria en seis horas.
Los investigadores de la Universidad del Norte de Carolina MaryAnne Drake, Ph. D., y Lee-Ann Jaykus, Phd., están desarrollando pruebas PCR para detectar bacterias patógenas viables, incluyendo L. monocytogenes, Salmonella, E.colli 0157:h7 and S. Aureus en productos lácteos.
Uno de los grandes retos de los métodos rápidos de detección de patógenos es detectar sólo las células viables y no las células muertas. La capacidad de decir si las células están vivas o muertas en una muestra es importante porque las células vivas tiene el potencial de crecer dentro de millones de células en solo unas horas, mientras que las células muertas no pueden.
Al usar métodos PCR que sean capaces de amplificar millones de veces secuencias específicas de DNA en unas cuantas horas, Drake y Jaykus lograron amplificar exponencialmente el DNA bacteriano específico aún si solo están presentes pocas células en la muestra.
Recientemente, Drake y Jaykus decidieron enfocarse en las secuencias de ácido ribonucleico ( RNA) porque son mejores indicativos de células vivas que el DNA. El RNA lleva a cabo las instrucciones codificadas del DNA. Esencialmente, RNA recopila proteínas, un aminoácido a la vez, usando la secuencia de nucleótidos a losl argo de una cadena de DNA ( ej., un gen). Existe más de un tipo de RNA. Por ejemplo,el RNA mensajero ( mRNA) lleva la información genética del núcleo para la síntesis de proteína; RNA de transferencia (tRNA) decodifica la información; un RNA ribosomal ( rRNA) es una cadena de moléculas incluída en la síntesis de proteínas.
Inicialmente, Drake y Jaykus estudiaron el rRNA como una posible secuencia para la amplificación, ya que esperaban que el rRNA de las células muertas se degradara después de su muerte. Sin embargo, sus estudios revelaron que el rRNA, aunque era menos estable que el DNA, no era un objetivo ideal en la mayoría de los alimentos ya que permanece estable después de la muerte celular. Recientes investigaciones de Drake y Jaykus, a igual que de otros investigadores, encontraron que el mRNA es bastante transitorio después de la muerte celular. Por tanto, mRNA es actualmente el objetivo para experimentos de amplificación.
Además de la detección actual de bacteria, Jaykus identificó un método para eliminar los inhibidores PCR de alimentos con el fin de usar un tamaño de muestra razonable en el análisis. El proceso de extracción concentra eficientemente las bacterias en las muestras de alimentos lácteos de una manera adecuada para la amplificación con PCR.
Una nueva base de datos ayuda a la identificación de patógenos:
Otra herramienta relativamente nueva que ayuda al personal de seguridad de alimentos a una detección temprana de patógenos es la Base de Datos de Cebas bacterianas. la base de datos, creada por los investigadores de la Universidad de Cornell, Martín Wiedman, Ph D., y Kathryn Boor, Ph. D. , y fundada por USDA and Dairy Management Inc., contiene huellas genéticas de organismos aislados por un número de procedimientos sub-tipo utilizados comúnmente. Al utilizar la base de datos de la web, los usuarios localizan las cepas aisladas que se han caracterizado por:
a) Sub-tipos de DNA identificados a través de una patrón de bandas, producidas por ribotipo o por electroforésis de campo pulsado;
b) Secuencias de DNA por genes de bacterias seleccionadas; ó
c) Datos fenotípicos como consumo de nutrientes y su uso ( ej. carbohidratos, grasas, etc)
Las cepas se pueden comparar entre ellas y/o a un nuevo acceso de un usuario. Además, un usuario puede localizar información acerca de todos los microorganismos de la base, como orígen ( animal, humano, alimento, ambiente), lugar específico de aislamiento y reportes de incidencias por enfermedades causadas por contaminación de alimentos ( si existen).
Este tipo de información puede ayudar a los procesadores de alimentos a obtener de forma rápida información segura acerca de una cepa de microorganismos, en la privacidad de su propio laboratorio sin añadir costos por la contratación de servicios de investigación de terceros. Esta base de datos interactiva se encuentra disponible en www.pathogentracker.net