Determinación de acidez en leche fluida: Comparación de resultados obtenidos por dos metodologías analíticas distintas.
RESUMEN
Una metodología analítica es habitualmente utilizada en Argentina para determinar acidez en leche fluida: la norma IRAM 14005, basada en la metodología Dornic de origen francés. En algunas regulaciones internacionales se indica como metodología de análisis la AOAC 947.05 Ed16∞. Como el fundamento de ambas es el mismo, titulación con solución de hidróxido de sodio utilizando fenolftaleina como indicador, los resultados obtenidos por una u otra se consideraron siempre equivalentes.
La presencia de algunos datos discordantes y tendencias, llevo a encarar un estudio estadístico para verificar o no la igualdad de los resultados obtenidos.
Como resultado del trabajo realizado sobre más de 500 muestras, se determinó, la existencia de diferencia significativa entre los resultados obtenidos por ambas tecnologías.
INTRODUCCIÓN
Lo que habitualmente se conoce como acidez de la leche es el resultado de una valoración, define Alais. Otro autor la define como: acidez titulable es el poder de combinación con una base.
La acidez de valoración es la suma de cuatro reacciones. Las tres primeras representan la acidez natural de la leche: acidez debida a la caseína, acidez debida a sustancias minerales y acidez debida a los fosfatos. La cuarta se denomina «desarrollada» es debida al ácido láctico y a otros ácidos producidos por la degradación de lactosa por parte de microorganismos.
El fundamento de medición es único y ya era indicado como usual en una publicación del año 1914. Se basa en el agregado, a un determinado volumen de leche, un volumen necesario de solución alcalina (hidróxido de sodio) de concentración perfectamente conocida, hasta alcanzar un punto de neutralización, el cual se determina por viraje de un indicador, generalmente la fenolftaleina que vira del incoloro al rosado a pH 8.4
Aunque el fundamento de medición es único, existen distintas variantes que difieren en la concentración de la solución alcalina, el volumen de leche a titular, la concentración de solución de la fenolftaleina, etc. Además hay distintos modos de expresión del resultado obtenido.
Respecto de variantes en los volúmenes y concentraciones, podemos indicar por ejemplo que el método indicado como usual consistía en el agregado de unas pocas gotas de solución de fenolfaleina como indicador a 100 cm3 de leche y posterior titulación con NaOH/10 hasta coloración rosa permanente. Sin embargo en dicho articulo, los autores proponen un nuevo método, de modo de determinar solo la acidez desarrollada: se miden 100 cm3 en un erlenmeyer de 200cc, se agregan 50 mL de agua destilada y 2 cm3 de solución saturada de oxalato neutro de potasio, se deja esperar no menos de 2 minutos y luego se titula con NaOH N/10.
Continuando con la descripción de estas variantes, vemos que hay diferentes métodos en los distintos países según:
Concentración de la solución de hidróxido de sodio:
Alemania N/4, Argentina N/9 o N/10, España N/9, Francia N/9, Holanda N/10, Estados Unidos N/10.
Concentración de fenolftaleina:
Alemania 2%, Argentina 2%, España 1%, Francia 1%, Holanda 2%, Estados Unidos 1%.
Volumen de solución de fenolftaleina:
Alemania 2mL, Argentina 3 o 4 gotas, España 0.5mL, Francia 0.1mL, Holanda no lo indica, Estados Unidos 20mL.
Volumen de leche sobre la que se titula:
Alemania 50mL, Argentina 10mL, España 10mL, Francia 10mL, Estados Unidos 20mL.
Color final:
Rosa en Argentina, España, Francia y Estados Unidos, en cambio en Alemania y Holanda se contrasta con el color de una solución de sulfato de cobalto.
Respecto a las formas de expresión, el grado Dornic (Dc º), empleado en Francia y Argentina, expresa el contenido de ácido láctico: la acidez expresada en grados dornic (Dc º) son las décimas de mL de la solución de hidróxido de sodio N/9 utilizados para valorar 10mL de leche. Como el peso molecular del ácido láctico es 90 g/mol, 1 º Dc equivale a 1mg de ácido láctico en 10mL de leche o a 0.01 % de ácido láctico.
El grado Soxhlet – Henkel (S.H.) utilizado en Alemania y en Suiza, no toma al ácido láctico como referencia. Equivale a 1mL de solución de hidróxido de sodio N/4 utilizado para valorar 100mL de leche. Tal vez este concepto es más adecuado ya que la valoración no mide solo el ácido láctico formado.
Por su parte la acidez expresada en grados Thorner son las décimas de mL de la solución de hidróxido de sodio N/10 utilizadas para valorar 10mL de leche.
Las variaciones en concentraciones y volúmenes de titulado, titulante e indicador, puede generar errores y posibles incongruencias en los resultados obtenidos por una u otra sobre la misma muestra de leche.
Ya Alais indica que si bien la medición de la acidez parece muy fácil hay varias causas de error.: la cantidad de indicador y el punto final de la valoración. Van Laik indica como errores posibles el indicador escogido y su concentración, la solución alcalina escogida y su concentración, la velocidad de la titulación, la temperatura a la que se trabaja, la dilución de la leche.
En los laboratorios lácteos de Argentina, habitualmente la determinación es realizada por la metodología nacional IRAM 14005 por ser una norma de vigencia nacional y por ser algo más rápida que la técnica alternativa: AOAC 947.05 Ed.16∞.
Ambas metodologías tienen el mismo fundamento: titulación ácido-base con solución de hidróxido de sodio utilizando fenolftaleina como indicador del punto de equivalencia.
Las diferencias se encuentran tal como hemos venido indicando en todos los casos, el volumen y la dilución de la porción de ensayo y en la normalidad de la solución titulante.
Los resultados obtenidos por una u otra, por el hecho de ser metodologías muy parecidas y por compartir el fundamento, se consideraban equivalentes.
Sin embargo al aumentar la comparación de datos entre laboratorios de las distintas empresas utilizando una u otra, debido fundamentalmente a situaciones de definición de límites tolerados y metodologías a aplicar en distintas regulaciones, comenzaron a aparecer algunos datos discordantes y tendencias.
Esto llevo a encarar un estudio estadístico para verificar o no la igualdad en los resultados obtenidos por una u otra.
MATERIALES Y MÉTODOS
Características de las muestras:
Se trabajo en conjunto con 8 empresas lácteas ubicadas en las principales zonas de producción láctea de Argentina, de modo de recolectar muestras representativas de la producción del país.
En total se seleccionaron 265 muestras de leche fresca, repartidas homogéneamente en el tiempo y el territorio, en cuatro meses de muestreo, las cuales se analizaron en los laboratorios del INTI.
Las muestras evaluadas se tomaron de las cisternas de camión en el recibo de leche de las empresas participantes.
La totalidad de las muestras se obtuvieron de tambos que refrigeran la leche.
El muestreo estuvo a cargo de las empresas participantes del estudio, quienes de acuerdo con el cronograma organizado previamente, remitieron las muestras a los laboratorios que INTI tiene paras lácteos en Rafaela y Miguelete.
Las muestras se identificaron con fecha y hora de muestreo y lugar de procedencia.
Fueron contenidas en envases plásticos de capacidades variables de 100 a 200mL, conteniendo leche hasta sus ¾ partes.
El hecho de utilizar los propios transportes de las empresas, permitió que las muestras se entraran en los laboratorios como máximo a 16 horas de la recolección. No se utilizo ningún tipo de conservante. La temperatura de refrigeración de las muestras desde su muestreo hasta el análisis fue siempre inferior a 10 º C.
Las muestras fueron analizadas siempre dentro de las 24 horas consideradas a partir de la hora de muestreo que se registraba en el envase y con una diferencia no mayor a 10 minutos por una técnica u otra.
Para completar el estudio, se analizó 36 veces la misma muestra utilizando cada una de las dos metodologías alternándolas, 18 veces con una y 18 veces con otra. La muestra seleccionada se solicito con un volumen mayor para emitir los análisis.
Zonas de muestreo:
El muestreo se organizo de modo de obtener muestras de leche cruda procedentes de las cuencas lecheras de las provincias de Santa Fe, Córdoba, la Pampa, Buenos Aires y Entre Ríos, según la siguiente descripción de las cuencas lecheras:
Buenos Aires:
Cuenca 1 Mar y Sierras
Cuenca 2 Oeste
Cuenca 3 Abasto Sur
Cuenca 4 Abasto norte
Entre Ríos:
Cuenca 5 Cuenca «B»
Cuenca 6 Cuenca «A»
Santa Fe:
Cuenca 7 Sur
Cuenca 8 Central
Córdoba:
Cuenca 9 Sur
Cuenca 10 Villa maría
Cuenca 11 Noreste
La Pampa:
Cuenca 12 La Pampa
Procedimientos resumidos de las metodologías utilizadas.
Resumen Metodología AOAC 947.05 (según recomendaciones JAOAC 30.130 y 34.239)
Tomar 20mL de muestra, agregarle 40mL de agua destilada hervida fría, más 2mL de fenolftaleina (preparada al 1 % en etanol al 95%). Titular con NaOH 0.1M factorizado hasta el primer tinte que persista 30 segundos. Agregar una gota más. Tomar el volumen final gastado.
Resumen Metodología IRAM 14005
Tomar 10mL de muestra, agregarle 3 gotas de fenolftaleína (preparada al 2% en etanol el 96%). Titular con NaOH 0.111M factorizado hasta primer tinte rosa que persista 30 segundos. Agregar una gota más. Tomar el volumen final gastado.
Formula de calculo: se utilizo una misma formula para ambas metodologías de modo de expresar los resultados en unidades o expresiones equivalentes:
RESULTADOS
Se obtuvieron en total 566 resultados analíticos.
De ellos, 530 corresponden al subtotal de los 265 de la aplicación de una metodología analítica y los 265 de aplicar la otra a cada una de las 265 muestras.
Los restantes 36 resultados analíticos corresponden al análisis de una misma muestra utilizando cada uno de las dos metodologías alternadas: 18 veces una y 18 veces con otra.
Se aplicaron dos modos de evaluación llegándose en ambos casos a las mismas conclusiones. Los modos de evaluación utilizados fueron: Diseño de Comparación de Pares para los 530 resultados provenientes del análisis de 265 muestras distintas, y Análisis de varianza de un solo factor para el caso de los 36 resultados sobre una misma muestra.
CONCLUSIONES
Utilizando dos modos distintos de evaluación estadística se concluye en todos los casos que existe diferencia estadísticamente significativa (con un nivel de confianza del 95%) entre los resultados analíticos obtenidos por una u otra metodología.