La calidad de la leche fermentada se volvió casi constante con respecto a los cambios en las densidades celulares de las bacterias ácido lácticas y ácido acéticas.
Se llevó a cabo la producción de leche fermentada usando un cultivo iniciador por lote repetido que contenía Lactococcus lactis subsp. cremoris y Acetobacter orientalis durante 14 días. El pH disminuyó a aproximadamente 4.3 y la leche solidificó cuando la proporción de mezcla de leche fermentada a leche fresca se fijó a un nivel tan alto como 10%.
La población microbiana cambió conforme el cultivo progresó y la densidad celular de las bacterias lácticas y acéticas finalmente llegaron a un valor constante. La calidad de la leche fermentada se volvió casi constante con respecto a los cambios en las densidades celulares de las bacterias acido lácticas y ácido acéticas.
Se inoculó Escherichia coli dentro de la leche fermentada para estimular la contaminación del medio. E. coli se fue eliminando con el progreso del cultivo por lote repetido y por tanto no mostró efectos adversos en la producción de la leche. Recientemente se ha reconocido que los alimentos fermentados contienen nutrientes esenciales necesarios para mantener una salud óptima así como compuestos no nutricionales que contribuyen a la prevención o retraso de enfermedades crónicas asociadas con la edad.
La leche fermentada es uno de los alimentos más populares y se ha consumido tradicionalmente por mucho tiempo en varios países. Existen diferentes tipos de leches fermentadas disponibles en el mercado japonés. La leche fermentada a veces también se elabora para propio consumo en los hogares.
Cuando la leche fermentada se hace en casa, se usan cultivos por lote repetido. Se han reportado varios estudios sobre cambios en la población microbiana en la producción y almacenamiento de leche fermentada, incluyendo al yogurt, ya que varios microorganismos coexisten en la leche fermentada.
Estos estudios, sin embargo, han sido para operaciones en lotes comunes, en los cuales el producto no se vuelve a usar como semilla para el siguiente lote. También han habido estudios que usan cultivos por lote repetido para la fermentación de leche. Entre estos, en la fermentación coexisten varios microorganismos, como una mezcla de cultivos de células inmovilizadas de bacterias ácido lácticas y levaduras de kefir y cultivos de gránulos de kefir que contienen varios tipos de microorganismos, pero no hay investigaciones sobre los cambios en la población microbiana de varios microorganismos con el progreso de cultivos por lote repetido.
Además no se ha reportado, que sepamos, cultivos por lote repetido para la producción de leche fermentada en donde se utilicen una mezcla de cultivos de dos tipos de bacterias, por ejemplo, bacterias ácido lácticas, y ácido acéticas, que es uno de los usos más populares de los cultivos iniciadores en Japón.
En este estudio, se investigaron los cambios en la población microbiana en leche fermentada durante un cultivo por lote repetido con un cultivo iniciador que contiene estos dos tipos de bacterias en particular.
Además, se usó Escherichia coli como un modelo contaminante para estudiar el efecto de la contaminación, ya que siempre hay riesgo de contaminación por varios microorganismos durante la fermentación realizada con cultivos por lote repetido en hogares.
Se utilizó uno de los cultivos iniciadores comerciales disponibles en el mercado japonés; consiste en un polvo secado por congelación que contiene Lactococcus lactis subsp. cremoris como una bacteria ácido láctica y Acetobacter orientalis como una bacteria ácido acética.
La proporción de la mezcla de estas bacterias no la dio a conocer el proveedor pero las densidades celulares de L. lactis subsp. cremoris y A. orientalis que se midió en un medio agar GYP-CaCO3 (glucosa,10g; extracto de levadura, 10g; Bacto peptona, 5g;CH3COONa·3H2O, 2g; MgSO4·7H2O, 10mg; NaCl, 10mg;Polisorbato 80, 500mg; CaCO3, 5g; agar, 12 g; agua destilada, 1 l; pH=6.8fue 6.7log10 y 2.9log10 ufc/g de cultivo iniciador seco, respectivamente.
Se utilizó en el estudio leche de larga vida (también conocida como leche ultrapasteurizada) comercializada bajo la marca Hokkaido 3.7 Milk (Nippon Milk Comunity, Tokio) y se compró en el mismo supermercado la misma hora para mantener una calidad de leche estándar. No se detectaron microorganismos en la leche en el análisis en la placa con agar GYP. La concentración de la lactosa en la leche fue de 44.7+ 0.50 g/l.
Para preparar la leche fermentada para sembrar con un cultivo por lote repetido, se añadió 1 g de cultivo iniciador a 200 ml de leche fresca y la mezcla se incubó a 20 °C por 24 h. La inoculación se realizó bajo condiciones asépticas. Después de la incubación, se midió el pH y se determinaron las densidades celulares de ambas bacterias ácido lácticas y ácido acéticas en un medio de agar GYP-CaCO3, las placas con agar se utilizaron para contar colonias de cada bacteria que se diferenciaron en la dilución dependiendo de las densidades celulares.
Leches fermentadasEs fácil distinguir estas bacterias en la placa con agar, ya que las colonias tienen apariencia diferente como lo describe el método de Mitruka y Bonner. Las colonias de L. lactis subsp. cremoris son de color blanco, puntiformes, convexas en elevación, margen completo y forma pequeña (0.5mmo), mientras que A. orientalis son de color café, circular, convexa en elevación, margen completo y forma colonias más grandes que las bacterias ácido lácticas (2mmo).
Además, la densidad celular de las bacterias ácido acéticas es más fácil de detectar en mezclas con mucho mayor cantidad de bacterias ácido lácticas, aunque sea mucho menor, tanto como 1/5000 o menos, que la de las bacterias ácido lácticas porque las bacterias ácido acéticas forman colonias claras junto a las miles de colonias de bacterias ácido lácticas. Se estableció en un experimento preliminar que la cuenta de colonias de bacterias ácido acéticas en la suspensión y en la mezcla con un número extremadamente mayor de bacterias ácido lácticas fueron similares.
En el cultivo por lote repetido, se realizaron dos corridas experimentales variando la proporción de la mezcla de la leche fermentada preparada a partir de leche fresca: una fue 1 v/v% (corrida 1), otra fue 10 v/v (corrida 2).
Las proporciones de mezcla utilizadas en el hogar no puede determinarse pero se dice que la proporción de la mezcla se ajusta a aproximadamente 10-20 v/v%. Primero se agregaron cien mililitros de cada mezcla en un matraz Erlenmeyer y se cultivó a 20 °C por 12h y posteriormente se maduró a 8 °C por 12 h en un refrigerador hasta el día siguiente. Se eligió una temperatura de cultivo de 20 °C, que es más favorable para la actividad de las bacterias ácido lácticas y ácido acéticas que las temperaturas bajas; no se eligieron arbitrariamente para poder obtener resultados básicos en un ejemplo simple de producción de leche fermentada, para que en experimentos posteriores se estudien diferentes temperaturas y cambie la temperatura conforme progresa el cultivo.
La leche fermentada se agitó con un agitador magnético en el matraz y se tomó una muestra antes de transferirlo a la misma proporción de mezcla de cada experimento al siguiente lote después de un intervalo de 24h. La corrida 1 paró después de una semana, mientras que la corrida 2 continuó por dos semanas. Se utilizó como modelo contaminante a E. coli HB101, se precultivó en un medio Luria-Bertani (LB) a 37 °C por 12h y posteriormente se inoculó en la leche fermentada de la corrida 2 a 7log10 ufc/ml al octavo día.
Se analizó la muestra extraída del matraz en términos de pH y se determinaron las concentraciones de ácido láctico, ácido acético y lactosa (si fuese necesario) así como las densidades celulares ya sea de las bacterias ácido lácticas ó ácido acéticas. Los datos se obtuvieron justo antes de transferir la leche fermentada al siguiente lote excepto para los datos del lote «0», los cuales se obtuvieron inmediatamente
después de que la leche fresca se mezclara con la leche fermentada inoculada. Las concentraciones de ácido láctico, ácido acético y lactosa se determinaron usando el F-kit L-/D-ácido láctico, F-kit ácido acético y
F-kit Lactosa (R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany),respectivamente. Después de dos semanas para la corrida 2, el cultivo por lote repetido continuó hasta el día 42 para mantener la leche fermentada inoculada y poder utilizarla en un experimento posterior.